隨著腫瘤免疫療法的興起，免疫系統(tǒng)在腫瘤研究中的作用受到了極大的關(guān)注。免疫系統(tǒng)的一些組分或其變化，已被用于腫瘤預后或預測腫瘤免疫治療的療效。例如，腫瘤浸潤淋巴細胞的存在被證明與一些癌癥的良好預后直接相關(guān)^[1]。然而，盡管一些患者存在高豐度的腫瘤浸潤性淋巴細胞，但并不能保證有良好的療效。因此，需要更深入地了解腫瘤組織中免疫細胞的類型及其激活狀態(tài)、功能和特異性。作為適應性免疫的關(guān)鍵細胞效應器，T細胞的抗原特異性由T細胞受體（TCR）決定，這意味著TCR庫（TCR repertoire）可以反應人類免疫系統(tǒng)的狀態(tài)^[2]。因此，TCR庫被認為是一種有前景的生物標志物，對TCR庫的研究有助于表征腫瘤細胞與宿主適應性免疫系統(tǒng)的相互作用，指導如何利用現(xiàn)有或新的治療方法有效地調(diào)節(jié)免疫反應，以及如何更好地預測腫瘤預后。

PART 01

在一項研究中，Charles等采用半定量多重PCR方法對44例I-IV期黑色素瘤患者的外周血和其中7例患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)樣本的TCR庫多樣性進行了研究，并探討其對臨床預后的潛在預測價值^[3]。作者使用兩個參數(shù)對TCR多樣性進行量化：反映V-J重排數(shù)量的多樣性豐富度（diversity richness，DR）和反映種群克隆性的多樣性均勻度（diversity evenness，DE）。作者根據(jù)DR和DE值分析患者的無進展生存期（PFS）和總生存期（OS），發(fā)現(xiàn)患者外周血中較高的TCR庫多樣性（DR和DE參數(shù)）與較長的PFS相關(guān)，而多樣性對患者OS沒有顯著影響（PFS和OS均從采樣時間開始計算）（圖1）。作者還進一步比較了7例患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫的多樣性（圖2）。盡管總體DR和DE值在血液和腫瘤之間無顯著差異，但對個體進行分析發(fā)現(xiàn)，患者1在血液和腫瘤中均具有最低DR值，腫瘤中具有最低DE值，在采樣后疾病進展迅速并在采樣四個月后死亡；相反，具有良好預后和較長生存期（接近4年）的患者8在血液和腫瘤中均表現(xiàn)出更高的TCR庫多樣性。綜上，這項研究表明黑色素瘤患者血液和腫瘤中TCR庫的多樣性具有潛在的預后價值。

圖1  DR和DE參數(shù)的數(shù)值高預示更長的PFS^[3]。通過ImmunTraCkeR?評估黑色素瘤患者血液中TCR庫的多樣性，并評估其對臨床結(jié)果的影響: (a) 低DR值 (<90%, n="12)和高DR值">90%, n = 32)患者的PFS (左圖)和OS (右圖)對比; (b) DE值低于或高于中位數(shù)的患者的PFS (左圖)和OS (右圖)的對比(n = 44)。采用log-rank檢驗進行分析

圖2  淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移瘤的多樣性可能為臨床結(jié)果提供有用信息^[3]。通過ImmunTraCkeR^?評估黑色素瘤患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫的多樣性（計算多樣性豐富度和均勻度）。血液和淋巴結(jié)DR值(左圖)和DE值(右圖)的對比

除了黑色素瘤，TCR庫對于乳腺癌、宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤同樣具有一定預后價值（表1）?？偟膩碚f，更高的TCR多樣性意味著免疫系統(tǒng)具有更好協(xié)調(diào)抗腫瘤反應的能力，所以在健康個體或疾病進展較好的患者中，TCR庫的多樣性會更高。

表1  TCR庫多樣性在腫瘤預后中的作用^[1]

PART 02

免疫檢查點抑制劑（ICIs）的使用已被證明可以提高多種類型腫瘤患者的生存期。到目前為止，用于預測ICIs療效的生物標志物主要包括PD-L1表達、腫瘤突變負荷（TMB）和腫瘤浸潤T細胞。近年來，一些研究試圖探索TCR庫多樣性和克隆性的改變與ICIs治療期間建立的保護性腫瘤特異性反應之間的關(guān)系，主要集中在靶向CTLA-4和PD-1的單克隆抗體這兩類ICIs對TCR庫多樣性的影響（表2）^{[1, 4]}。由于難以獲得縱向腫瘤組織樣本，這些研究大多使用循環(huán)T細胞，少數(shù)使用腫瘤浸潤T細胞。

表2  不同腫瘤研究中ICIs治療后的TCR庫分析^[1]

在一項試點研究中，Postow等人分析了12例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受ipilimumab（anti-CTLA-4 antibody）治療前的外周血TCR庫多樣性，以確定治療前TCR庫多樣性是否與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)^[5]。作者通過豐富度（richness，觀察到的V-J重排）和均勻度（evenness，特定V-J重排頻率之間的相似性）這兩個參數(shù)來研究TCR庫的多樣性。臨床獲益通過ipilimumab開始治療后腫瘤負荷減輕或疾病穩(wěn)定時間延長至少9個月的證據(jù)來確定。結(jié)果顯示（圖3），有無臨床獲益的患者在TCR庫豐富度（p = 0.033）和均勻度（p = 0.028）上都存在顯著差異，低豐富度（n = 0/5, p = 0.081）和低均勻度（n = 0/7, p = 0.01）患者均沒有臨床獲益。該研究表明，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者外周血中基線TCR多樣性與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)。

圖3  A，有臨床獲益的患者在基線時TCR庫的豐富度更高(p = 0.033)；B，有臨床獲益的患者在基線時TCR庫的均勻度更高(p = 0.028)^[5]

此外，一些研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4治療可以增加外周血中TCR庫的多樣性。例如，為了評價tremelimumab阻斷CTLA4對PBMC的免疫調(diào)節(jié)作用，Robert等人利用NGS評估了21例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受tremelimumab治療前、治療30天和60天后，PBMC細胞中TCR V-beta CDR3的變化^[6]。結(jié)果顯示（圖4），接受tremelimumab治療后，19例患者TCR V-beta CDR3的unique productive sequences中位數(shù)增加了30%，另外2例中位數(shù)下降30%；治療后的豐富度（P < 0.01）和Shannon多樣性指數(shù)（P < 0.04）變化顯著。相比之下，從4名健康人的TCR V-beta CDR3多樣性在1年內(nèi)沒有顯著變化。這項研究說明用tremelimumab阻斷CTLA4可以使外周T細胞庫多樣化，闡明這類抗體如何調(diào)節(jié)人類的免疫系統(tǒng)。

圖4  Unique productive sequences絕對數(shù)值的變化^[6]。A，來自21名黑色素瘤患者(GA，黑色)和4名健康人 (HD，灰色)的基線和tremelimumab治療后樣本之間的變化。B，標準化的TCR V-beta CDR3庫多樣性。分析比較PBMC樣本的基線和tremelimumab治療后CDR3庫的變化，這些數(shù)值進行歸一化，以可比性的方式顯示治療后的增加和減少

關(guān)于抗PD-(L)-1治療，一些研究也證明了更高的基線外周TCR庫多樣性與臨床獲益之間的關(guān)聯(lián)。例如，Han等人對NSCLC患者PD-1+ CD8+ T細胞的TCRβ CDR3進行測序，以研究其在預測NSCLC患者對抗PD-1/ PD-L1治療反應中的作用（圖5）^[7]。兩個獨立的隊列（隊列A，n = 25；隊列B，n = 15)分別作為發(fā)現(xiàn)組和驗證組。在隊列A中， ICB治療前PD-1+ CD8+ T細胞TCR庫多樣性高的患者對ICB治療表現(xiàn)出更優(yōu)的臨床響應和更長的PFS（6.4個月vs 2.5個月，HR，0.39；95%[CI]，0.17-0.94；P = 0.021）。類似的結(jié)果在隊列B中也得到了驗證，說明外周血PD-1+ CD8+ T細胞中的TCR庫多樣性可以作為預測NSCLC對ICB治療結(jié)果的生物標志物。

圖5  TCR庫多樣性與PD-1或PD-L1抑制劑治療的反應和PFS的相關(guān)性^[7]。A，隊列A中PD-1/PD- l1抑制劑治療后DC和PD亞組PD-1+ CD8+ TCR多樣性的比較(n = 25)。B，使用ROC曲線隊列A中區(qū)分PD患者和DC患者(n = 25)。C，隊列A的PFS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進行分層(n = 25)。D，隊列B的PFS通過PD-1+ CD8+ TCR多樣性進行分層 (n = 15)。E，隊列A的OS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進行分層 (n = 25)。F，隊列B的OS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進行分層(n = 15)。G, TCR多樣性對判斷PD-1或PD- L1抑制劑的臨床反應(DC vs PD)的敏感性和特異性(n = 40;DC, n = 23, PD, n = 17)

然而，Hogan等人在一項研究發(fā)現(xiàn)TCR庫多樣性與anti-PD-1治療結(jié)果存在負相關(guān)（圖6）^[8]。在該研究中，作者采用multi-N-plex PCR技術(shù)測試了接受anti-CTLA4 (n = 42) 或anti-PD1 (n = 38)治療的黑色素瘤患者在治療前PBMC的TCR庫組合多樣性均勻度（DE50，其數(shù)值越低，代表TCR克隆越多，多樣性越少）。在多變量回歸模型中評估治療結(jié)果、臨床變量和DE50之間的相關(guān)性，并通過Fisher精確檢驗進行驗證。結(jié)果顯示，低DE50數(shù)值預示著患者anti-PD-1治療有良好反應和更長的PFS，但是對于anti-CTLA-4治療預示著較差的臨床獲益。不同研究結(jié)果的差異表明，需要更深入的研究，以助于更好地了解其他因素對TCR庫變化的影響。

圖6  治療前TCR多樣性的均勻度^[8]。A，散點圖顯示對anti-CTLA-4治療有反應或無反應患者的基線DE50。N = 42。虛線，20.03%。B，散點圖顯示對anti-PD-1治療有反應或無反應患者的基線DE50水平。N = 38。虛線，20.4%。用Fisher精確檢驗計算P值

PART 03

盡管缺乏對TCR庫如何影響癌癥發(fā)展的了解，但目前已有明確的證據(jù)表明，TCR庫在作為預測腫瘤進展或預測ICIs治療效果的生物標志物方面具有巨大的潛力。

熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，在時序樣本檢測中，通過檢測患者體內(nèi)TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進展或復發(fā)。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。

熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：

歡迎后臺留言咨詢。

參考文獻：

[1] Aran A, Garrigós L, Curigliano G, Cortés J, Martí M. Evaluation of the TCR Repertoire as a Predictive and Prognostic Biomarker in Cancer: Diversity or Clonality? Cancers (Basel). 2022 Mar 31;14(7):1771. doi: 10.3390/cancers14071771. PMID: 35406543; PMCID: PMC8996954.

[2] Porciello N, Franzese O, D'Ambrosio L, Palermo B, Nisticò P. T-cell repertoire diversity: friend or foe for protective antitumor response? J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 22;41(1):356. doi: 10.1186/s13046-022-02566-0. PMID: 36550555; PMCID: PMC9773533.

[3] Postow MA, Manuel M, Wong P, Yuan J, Dong Z, Liu C, Perez S, Tanneau I, Noel M, Courtier A, Pasqual N, Wolchok JD. Peripheral T cell receptor diversity is associated with clinical outcomes following ipilimumab treatment in metastatic melanoma. J Immunother Cancer. 2015 Jun 16;3:23. doi: 10.1186/s40425-015-0070-4. PMID: 26085931; PMCID: PMC4469400.

[4] Joshi K, Milighetti M, Chain BM. Application of T cell receptor (TCR) repertoire analysis for the advancement of cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2022 Feb;74:1-8. doi: 10.1016/j.coi.2021.07.006. Epub 2021 Aug 25. PMID: 34454284.

[5] Postow MA, Manuel M, Wong P, Yuan J, Dong Z, Liu C, Perez S, Tanneau I, Noel M, Courtier A, Pasqual N, Wolchok JD. Peripheral T cell receptor diversity is associated with clinical outcomes following ipilimumab treatment in metastatic melanoma. J Immunother Cancer. 2015 Jun 16;3:23. doi: 10.1186/s40425-015-0070-4. PMID: 26085931; PMCID: PMC4469400.

[6] Robert L, Tsoi J, Wang X, Emerson R, Homet B, Chodon T, Mok S, Huang RR, Cochran AJ, Comin-Anduix B, Koya RC, Graeber TG, Robins H, Ribas A. CTLA4 blockade broadens the peripheral T-cell receptor repertoire. Clin Cancer Res. 2014 May 1;20(9):2424-32. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-13-2648. Epub 2014 Feb 28. Erratum in: Clin Cancer Res. 2015 Jul 15;21(14):3359. PMID: 24583799; PMCID: PMC4008652.

[7] Han J, Duan J, Bai H, Wang Y, Wan R, Wang X, Chen S, Tian Y, Wang D, Fei K, Yao Z, Wang S, Lu Z, Wang Z, Wang J. TCR Repertoire Diversity of Peripheral PD-1+CD8+ T Cells Predicts Clinical Outcomes after Immunotherapy in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Immunol Res. 2020 Jan;8(1):146-154. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-19-0398. Epub 2019 Nov 12. PMID: 31719056.

[8] Hogan SA, Courtier A, Cheng PF, Jaberg-Bentele NF, Goldinger SM, Manuel M, Perez S, Plantier N, Mouret JF, Nguyen-Kim TDL, Raaijmakers MIG, Kvistborg P, Pasqual N, Haanen JBAG, Dummer R, Levesque MP. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunol Res. 2019 Jan;7(1):77-85. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0136. Epub 2018 Nov 13. PMID: 30425105.