基因治療和細(xì)胞治療

1990年美國(guó)醫(yī)學(xué)家W.F. Anderson對(duì)患有腺苷脫氨酶缺乏癥的4歲女孩進(jìn)行基因治療，成為世界上首個(gè)基因治療成功的范例和重要里程碑。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，基因治療為患者“從根本上進(jìn)行疾病治療”帶來(lái)了新的希望。

按照治療方式，基因治療可分為2類，體內(nèi)治療是直接向血液或者目標(biāo)器官中注射攜帶所需基因的載體，如單基因遺傳病、血友病及眼科疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。體外治療，又可稱為細(xì)胞治療，是把患者的細(xì)胞從體內(nèi)移出，通過(guò)在體外對(duì)于細(xì)胞進(jìn)行基因改造，重新輸入至患者的體內(nèi)。其中嵌合抗原受體T細(xì)胞療法（CAR-T）是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法。

截至目前，已有20余款基因治療藥物和 8款CAR-T產(chǎn)品獲得各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)?；蚝图?xì)胞治療藥物憑借先進(jìn)的生物技術(shù)和廣闊的治療前景，將在未來(lái)人類疾病的防治中發(fā)揮重要作用。

慢病毒整合

對(duì)于基因和細(xì)胞治療而言，基因遞送的方式和效率直接決定了藥物的治療效果，因此載體的選擇顯得尤為重要。由于感染譜廣泛，可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞，長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因，慢病毒系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于基因和細(xì)胞治療等實(shí)驗(yàn)中。

病毒整合是慢病毒正常生活周期（Lifecycle）的重要環(huán)節(jié)（圖1）。病毒識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體，將RNA及蛋白轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。隨后RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，整合酶識(shí)別病毒DNA攜帶的LTR，以隨機(jī)或半隨機(jī)方式切斷宿主基因組，產(chǎn)生的粘性末端會(huì)與病毒DNA連接，從而完成外源基因的插入。病毒整合是外源基因表達(dá)、實(shí)現(xiàn)基因治療效果的必要條件。

圖1 慢病毒生活周期（Lifecycle）

病毒載體整合至宿主細(xì)胞基因組，可能破壞基因組的內(nèi)源性基因表達(dá)1。隨著研究的進(jìn)一步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)慢病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合不是完全隨機(jī)的，其中慢病毒整合更容易發(fā)生在活躍轉(zhuǎn)錄的基因中，存在致病的潛在風(fēng)險(xiǎn)2。2005年巴黎進(jìn)行的治療X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在接受基因治療的患者中出現(xiàn)明顯的白血病或惡性克隆擴(kuò)增的癥狀3。

對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療，研究顯示部分病毒插入突變與治療后復(fù)發(fā)相關(guān)。Shah et al2等報(bào)道一名急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患者，接受抗CD22 CAR-T細(xì)胞療法后復(fù)發(fā)，可能是由于CAR意外插入CBL基因、53天后出現(xiàn)的二次克隆擴(kuò)增。Ruella et al4等報(bào)道一名ALL患者接受CAR-CD19治療的復(fù)發(fā)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)攜帶CAR插入位點(diǎn)的CAR-B細(xì)胞克隆，研究人員最終確定，癌變B細(xì)胞里的CAR是制作CTL019細(xì)胞時(shí)意外引入的。癌變的B細(xì)胞獲得了CAR，便遮擋了CD19，CAR-T因此無(wú)法識(shí)別癌細(xì)胞。

整合位點(diǎn)分析的法規(guī)要求

基于整合載體的潛在致病性，國(guó)內(nèi)外法規(guī)均有相關(guān)安全性分析的條款。美國(guó)FDA 最新發(fā)布《嵌合抗原受體(CAR)T 細(xì)胞治療的研發(fā)考量》，指出“對(duì)包括整合載體的產(chǎn)品推薦進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，因?yàn)檎陷d體可能會(huì)增加延遲不良事件的風(fēng)險(xiǎn)”。EMA和IHC等機(jī)構(gòu)同樣推薦在治療過(guò)程中或者長(zhǎng)期隨訪中，分析整合位點(diǎn)。

國(guó)家藥監(jiān)局5月最新推出《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》明確指出，“基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)：由于其關(guān)系到產(chǎn)品的安全性和有效性，需采用適用的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，探索其與安全性和療效的相關(guān)性”。同期發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》指出，“分析載體在基因組中的整合方式和整合位點(diǎn)的分布趨勢(shì)，評(píng)估其插入導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變、基因失活/激活，或細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)”。

病毒整合位點(diǎn)分析方法

病毒整合最初采用Southern blot和基因組文庫(kù)來(lái)分析整合位點(diǎn)特征5。 PCR技術(shù)因操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，逐漸取代Southern blot成為病毒整合的主要分析方法。根據(jù)PCR技術(shù)路線差異，病毒整合主要分為反向PCR（Reverse PCR）、接頭PCR(Ligated Mediated PCR, LM-PCR)和線性擴(kuò)增PCR(Linear Amplification Mediated PCR, LAM-PCR)等。

反向PCR，將DNA酶切打斷后連接成環(huán)，設(shè)計(jì)反向引物擴(kuò)增，可得到病毒整合位點(diǎn)兩側(cè)的未知序列。由于連接酶成環(huán)效率較低，反向PCR使用受限。LM-PCR，在DNA酶切打斷后，兩端連接含接頭，根據(jù)病毒DNA和接頭固定序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，即解鎖病毒整合位點(diǎn)的位置信息（圖2）。LM-PCR原理簡(jiǎn)單，易于操作，從發(fā)明之日起應(yīng)用至今。LAM-PCR，首先線性擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增得到的單鏈產(chǎn)物通過(guò)LM-PCR將單鏈擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物繼續(xù)放大。由于引入線性擴(kuò)增，LAM-PCR的靈敏度和特異性極大提高，超過(guò)反向PCR和LM-PCR，應(yīng)用廣泛（圖2）。

圖2 反向PCR、LM-PCR和LAM-PCR技術(shù)路線示意圖

傳統(tǒng)PCR技術(shù)分析整合位點(diǎn)依賴限制性內(nèi)切酶酶切，存在一定偏好性；同時(shí)電泳或者一代測(cè)序靈敏度較低，分析克隆數(shù)量有限。隨著2005年第一臺(tái)高通量測(cè)序儀羅氏454問(wèn)世，二代測(cè)序（NGS）逐步取代PCR，成為整合位點(diǎn)分析的主流技術(shù)。由于測(cè)序數(shù)據(jù)量大，二代測(cè)序極大地?cái)U(kuò)展了整合位點(diǎn)數(shù)量，特別是低頻整合克隆的檢出，為藥物開發(fā)提供更多可參考信息。

高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程與PCR相比更為復(fù)雜。常用文庫(kù)構(gòu)建方法包括LM-PCR、LAM-PCR和非限制性酶切LAM-PCR（nrLAM-PCR）等（nrLAM-PCR以LAM-PCR為基礎(chǔ)，剔除了內(nèi)切酶酶切操作）。LAM-PCR和nrLAM-PCR方式建庫(kù)，在線性擴(kuò)增中引入生物素標(biāo)記引物和鏈霉親和素標(biāo)記磁珠，流程復(fù)雜，成本較高6。LM-PCR通過(guò)2步PCR富集插入位點(diǎn)序列，6~7h即可完成建庫(kù)，操作簡(jiǎn)單，大大加快建庫(kù)周期，是慢病毒插入位點(diǎn)檢測(cè)的理想選擇。

熙寧生物最新推出慢病毒整合位點(diǎn)NGS檢測(cè)技術(shù)bLM-PCR。bLM-PCR以LM-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，與其他建庫(kù)方法相比，操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短且成本低廉。此外，慢病毒兩端各有一個(gè)LTR序列，兩個(gè)LTR均通過(guò)LM-PCR發(fā)生擴(kuò)增，因此常規(guī)建庫(kù)方法有一半reads是LTR與Provirus（前病毒插入序列）的無(wú)用整合信息。熙寧bLM-PCR通過(guò)引入靶向Provirus的特異性探針（圖3 blocker），阻斷5’LTR無(wú)效整合位點(diǎn)reads的擴(kuò)增，可節(jié)省一半的測(cè)序數(shù)據(jù)量和一半的測(cè)序成本。

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圖3 bLM-PCR建庫(kù)技術(shù)路線

參考文獻(xiàn)

1.Desfarges, S. & Ciuffi, A. Retroviral integration site selection. Viruses 2, 111–130 (2010).

2.Shah, N. N. et al. Clonal expansion of CAR T cells harboring lentivector integration in the CBL gene following anti-CD22 CAR T-cell therapy. Blood Adv. 3, 2317–2322 (2019).

3.孟坡. 慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)研究方法. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 5, 42–64 (2008).

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5.Nusse, R. et al. Retroviral insertional mutagenesis in murine mammary cancer. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 226, 3–13 (1985).

6.Hamada, M. et al. Integration Mapping of piggyBac-Mediated CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Analyzed by Novel Tagmentation-Assisted PCR. EBioMedicine vol. 34 18–26 (2018).

熙寧生物按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南(試行)》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》要求建立NGS實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室配備illumina CN500測(cè)序儀（注冊(cè)備案）、Covaris M220基因打斷儀和安捷倫自動(dòng)化電泳儀4150等儀器，可完成常規(guī)文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。技術(shù)團(tuán)隊(duì)核心人員有5-10年NGS方法開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，曾在頭部基因檢測(cè)公司牽頭完成腫瘤大panel檢測(cè)、全外顯子測(cè)序和RNAseq等項(xiàng)目。