藥物代謝動(dòng)力學(xué) (Pharmacokinetic, PK) 是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律的學(xué)科，血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律尤為重要。藥物濃度檢測(cè)方法建立中，針對(duì)藥物的獨(dú)特型抗體可特異性識(shí)別基質(zhì)中的藥物，是PK研究不可或缺的檢測(cè)試劑，而由于抗藥抗體特異性識(shí)別位點(diǎn)的不同，PK中檢測(cè)的藥物類型也就有了一定差別。  

小劇場(chǎng):

在蛋白類藥物的藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的過程中，藥物檢測(cè)有不同的類型，主要有兩種：一種是檢測(cè)游離的藥物濃度，另一種是檢測(cè)總的藥物濃度，即包含游離的藥物以及和靶點(diǎn)結(jié)合的藥物濃度。PK檢測(cè)方式可根據(jù)臨床需求，藥物機(jī)制與檢測(cè)目的來決定。

檢測(cè)游離的藥物，通常采用競(jìng)爭(zhēng)性的抗藥物抗體，即該抗體結(jié)合藥物的位點(diǎn)和藥物識(shí)別靶點(diǎn)的位點(diǎn)一致或是存在空間位阻。

小劇場(chǎng):

檢測(cè)總的藥物濃度，通常采用非競(jìng)爭(zhēng)性抗體，藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合并不能干擾抗體對(duì)藥物的捕獲能力。

小劇場(chǎng)：

所以在PK方法開發(fā)的階段，首先要做的就是根據(jù)臨床的目的來篩選合適的抗體。

對(duì)于檢測(cè)總的藥物濃度的PK項(xiàng)目而言，非競(jìng)爭(zhēng)性抗體的性能決定了方法的靈敏度。一旦抗體的非競(jìng)爭(zhēng)性效果不好，那結(jié)合了靶點(diǎn)的藥物就不能被捕獲或者是檢測(cè)。

小劇場(chǎng)：

眾所周知，抗體的制備有很大的偶然性，篩選到一對(duì)恰到好處的抗藥抗體是一件足夠幸運(yùn)的事情。如果項(xiàng)目急，時(shí)間緊，想要測(cè)試總的藥物濃度，篩選的抗體非競(jìng)爭(zhēng)性效果并不十分出色，那么就束手無策了嗎？并不是，實(shí)驗(yàn)證明，PK藥物濃度檢測(cè)中的靶點(diǎn)干擾是可以被解決的。

靶點(diǎn)干擾是基質(zhì)效應(yīng)中的一種類型，意味著基質(zhì)中游離的靶點(diǎn)會(huì)對(duì)PK檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，尤其是當(dāng)基質(zhì)環(huán)境中存在高濃度靶點(diǎn)時(shí)（如ug/ml級(jí)別），通常會(huì)影響樣品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們常用的解決基質(zhì)效應(yīng)的辦法是增大MRD（最小稀釋倍數(shù)），但有時(shí)加大MRD并不會(huì)起效。下面示例一個(gè)Total PK的檢測(cè)方法，其靶點(diǎn)濃度高達(dá)10ug/ml, 結(jié)果顯示簡(jiǎn)單的MRD處理并不能解決靶點(diǎn)帶來的干擾。

在大分子檢測(cè)領(lǐng)域，藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和免疫原性（ADA）的檢測(cè)因?yàn)槎际桥潴w結(jié)合實(shí)驗(yàn)，所以具有很大的相通性。而在免疫原性的檢測(cè)中，靶點(diǎn)干擾是分析方法發(fā)展領(lǐng)域公認(rèn)的主要挑戰(zhàn)之一，現(xiàn)已提出多種前處理方式來緩解這一問題，如酸或堿解離，親和捕獲洗脫（ACE），酸解離固相萃取等等。既然相似，為何不借用一下它山之石呢？所以對(duì)于上述的有嚴(yán)重靶點(diǎn)干擾的PK檢測(cè)，我們果斷嘗試酸解離以及酸解離固相萃取的嘗試。

這種方式首先要考慮檢測(cè)的藥物是否耐酸，要用什么酸，酸化pH為多少合適；其次考慮藥物與抗體的反應(yīng)體系pH，即酸化后的樣品采用什么堿液，酸堿比例多少合適，中和后的反應(yīng)體系后pH多少合適（中性，弱酸或弱堿），在這個(gè)方法中選擇了乙酸和Tris-HCL 緩沖液作為酸化和中和的Buffer，比較了不同pH反應(yīng)體系下干擾的結(jié)果（如下表，黃色為中性反應(yīng)體系，綠色為酸性反應(yīng)體系）：

同時(shí)進(jìn)行了選擇性測(cè)試，在中性反應(yīng)體系中，選擇性通過率較低不能滿足指導(dǎo)原則要求，而在弱酸性條件下選擇性結(jié)果通過，滿足指導(dǎo)原則要求。

這表明，酸化處理并在弱酸性體系下反應(yīng)條件下靶點(diǎn)干擾的問題完美解決。

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酸化

酸化打開藥物與靶點(diǎn)的預(yù)結(jié)合，提取檢測(cè)目標(biāo)，再酸化使其在Buffer環(huán)境中解離，去除基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。

這種方式與第一種方式相比，操作稍顯復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)員的技能要求更高些，且完成一次檢測(cè)所需時(shí)間更長(zhǎng)，但其最突出的優(yōu)點(diǎn)就是可以盡可能的去除基質(zhì)效應(yīng)。這種方式除了要考慮酸化處理需要考慮的問題之外，還需考慮提取體系的pH。比較不同提取體系效果的結(jié)果如下：

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前情提要：樣品經(jīng)過酸化后，藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合已打開，藥物與抗體重新結(jié)合······

固相萃取

當(dāng)然，以上處理的小技能并不是萬能的，并非一切有關(guān)基質(zhì)效應(yīng)的問題都可以用它來解決，而且雖然在ADA的檢測(cè)中酸化處理樣品已經(jīng)是一個(gè)很成熟的辦法，但是將其用于PK檢測(cè)時(shí)也遇到很多的問題。與ADA相比，PK檢測(cè)更加的嚴(yán)苛，是定量的檢測(cè)，酸化的方法并沒有常規(guī)方法穩(wěn)健等種種問題，上面只是提供一種思考方式，當(dāng)我們?cè)诜治龉ぷ髦杏龅絾栴}時(shí)，可打開思維，尋找新的出路。

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熙寧生物|精翰生物免疫分析團(tuán)隊(duì)具有20多年的PK檢測(cè)分析經(jīng)驗(yàn)，藥物類型覆蓋單克隆抗體、雙/多特異性抗體、ADC、融合蛋白/重組蛋白，其中單克隆抗體＞50種，雙/多特異性抗體＞30個(gè)藥物，40+臨床試驗(yàn)，ADC類藥物＞15種，20+臨床試驗(yàn)，在實(shí)戰(zhàn)種積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，可為申辦方提供一站式的檢測(cè)分析服務(wù)，歡迎前來交流溝通。